Первое геодезическое исследование здания было проведено в 1927 году. В 1939–1940 гг. геодезические измерения были повторены Ленинградским Трестом геодезических работ и инженерных изысканий (ГРИИ) по расширенной программе. В подвалах здания были заложены 14 новых нивелировочных марок, а вокруг собора – 5 контрольных реперов. С их помощью более точно было проведено измерение осадок.
Изучение их результатов показало, что заметного оседания здания по сравнению с 1927 годом не произошло.

При музее в 1940 году создан научно-методический совет, который на основе изучения опросов посетителей разработал «Основные методические приемы и тематику проведения экскурсий в бывшем Исаакиевском соборе».

22 июня 1941 года началась Великая Отечественная война, а уже на следующий день, 23 июня, на заседании Ленгорсовета и Обкома ВКП(б) был принят план по защите памятников Ленинграда. В группу особо ценных объектов был включен Исаакиевский собор. По итогам совещания были приняты меры по максимально возможному сохранению здания.

В связи с призывом в РККФ директора музея И. М. Штрейхера и заместителя директора Е. И. Востокова исполнение обязанностей директора Государственного антирелигиозного музея было возложено на ученого секретаря музея Николая Владимировича Федоровича.

Предварительного мобилизационного плана в музее не было. Экстренный отбор экспонатов производился научным отделом музея в лице Н. В. Федоровича, Е. И. Лединкиной, Н. А. Гребенщикова, Н. Н. Дмитриевой, Л. П. Шейнина, К. К. Плахова.
Были отобраны: две деревянные модели Исаакиевского собора, ценные чертежи по его постройке, иконы и картины, бюст О. Монферрана, живописные картины, предметы из благородных металлов из спецкладовой. Всего отправлено 148 предметов в 7 ящиках.
Первая очередь была отправлена в г. Сарапул (Удмуртия) 5 июля.

К 9 июля 1941 года были окончены работы по маскировке куполов Исаакиевского собора. Золоченые главы собора являлись хорошим ориентиром для фашистской авиации, поэтому решение об их маскировке (в отличие от остальных городских доминант) было принято одним из первых, на второй день войны.
Под руководством инженеров Ермоленко и Жуковского альпинисты-верхолазы закрасили купола собора защитной серой масляной краской. Окраску производили несколько человек сразу со всех сторон, спускаясь сверху по веревкам, закрепленным за перила у верхнего фонарика.

Работу музея прервала Великая Отечественная война. 15 июля 1941 года Исаакиевский собор был закрыт для посетителей.
Согласно приказу от 15 июля 1941 года Управления культурно-просветительных предприятий Ленсовета на базе Антирелигиозного музея в Исаакиевском соборе было создано Объединенное хозяйство музеев. В него вошли: Государственный антирелигиозный музей, Музей истории и развития Ленинграда, Летний дворец Петра I, Домик Петра I, а позже – дворцы-музеи Пушкина, Павловска, Петродворца, Ораниенбаума и Гатчины. Здание Исаакиевского собора использовалось как хранилище эвакуированных музейных фондов, которые не удалось отправить в тыл.
В соборе хранилось более ста тысяч экспонатов: картины, акварели, гравюры, чертежи, фотографии, книги, журналы, мебель, ткани и вышивки, медали и монеты, изделия из бронзы, стекла и фарфора. Небольшой группе музейных работников было поручено беречь эти вещи.

23 августа в эвакуацию в удмуртский город Сарапул из Государственного антирелигиозного музея отправлено 6 ящиков. В два ящика были упакованы 682 музейных предмета: мелкие предметы культа, деревянные скульптуры, иконы из дерева и перламутра, предметы из металла. В четырех ящиках отправлен старый архив научной части (научные работы, библиография, списки, картотеки).

25 августа 1941 года директор Государственного Антирелигиозного музея Н. В. Федорович освобожден от занимаемой должности и командирован руководить эвакуацией коллекции Гатчинского дворца-музея.
Вместо него исполнять обязанности директора была назначена научный сотрудник музея Евдокия Игнатьевна Лединкина, она также возглавила Объединенное хозяйство музеев.

29 октября 1941 года в 15:30 на расстоянии 18 метров от северо-западного окна на гранитном тротуаре разорвался снаряд. На месте взрыва образовалась воронка диаметром до 3–3,5 метров при глубине 1–1,25 метра. Общее направление действия осколков было по диагонали с северо-запада на юго-восток.
Северо-западная стена и северный портик у западной колокольни покрылись многочисленными выбоинами и сколами. Некоторые выбоины в мраморной облицовке достигали глубины 10–15 см. Особенно сильно пострадал поясок над цокольной частью здания. На колоннах северного портика имелись выбоины и отколы глубиной до 2–5 см при среднем диаметре до 10–15 см.; пострадали 10 из 16 гранитных колонн.
На северном портике пострадали горельеф в западной нише и скульптура над большими дверями.
Были выбиты оконные стекла (всего разбито и повреждено 73 фрагмента окна), но кирпичная заделка окон осталась невредимой, несмотря на то, что северо-западное окно приняло на себя удар взрывной волны.
Был поврежден временный дощатый забор с западной части северного портика. Водопровод, канализация, телефонные провода и электропровода не пострадали и действовали нормально. Несчастий с людьми не было. Воронка к 16:30 была засыпана восстановительной бригадой МПВО.

При аварии были залиты коридоры и подвалы. Откачка воды производилась до 28 апреля. Документы музейного отдела были перенесены в верхнюю бухгалтерию. Приспособленные под жилье для хранителей из пригородных музеев подвальные помещения стали непригодны для дальнейшего проживания; часть хранителей получили служебные квартиры, часть была эвакуирована.

В 14:00 при артобстреле города в юго-западный угол кровли Исаакиевского собора, у фигур ангелов со светильниками, попал снаряд. В двух местах была пробита медная кровля и поврежден парапет; в чердачном помещении повреждена металлическая анкерная тяга, скрепляющая стены юго-западного угла здания; пробита служебная металлическая лестница в чердачное помещение; повреждены кладка юго-западной звонницы и мраморная облицовка карниза.

Юго-восточная часть собора была залита водой, вследствие чего подмокли ящики, в которых хранились экспонаты из Гатчины, Ораниенбаума и Петергофа. Вещи в них не промокли, но потребовались физические усилия ослабших после первой блокадной зимы хранителей для перестановки упакованных экспонатов и проверки их состояния.

В годы Великой Отечественной войны, несмотря на все меры, принятые для сохранения здания Исаакиевского собора, оно серьезно пострадало от фашистских бомб и снарядов. Значительные повреждения были причинены и витражу в алтарном окне. В акте от 26.01.1943 указывается: «…силой взрывной волны разрыва немецкой бомбы вблизи собора… в витраже у центрального алтаря выбита часть стекол (фон) из нижних свинцовых переплетов… (в нижней части витража стекла выбиты со свинцовым переплетом)».

Исаакиевский собор был ранен 5 декабря 1943 года шальным, случайным снарядом, когда обстрелы утратили уже свою силу и длительность. Это случилось днем, когда все сотрудники работали в соборе. Снаряд покалечил одну из колонн западного портика, отбив от нее порядочный кусок гранита. Удар был так силен, что около этого портика разошлись и вздыбились плиты тротуара. Но внутри здания он не отозвался ни звуком, ни сотрясением

Сразу после снятия блокады в Исаакиевском соборе была произведена техническая очистка кровель, карнизов и водосточных труб. Восстановлено электроосвещение, в том числе семи больших люстр собора. Начаты работы по очистке от плесени и образовавшихся от разложения мастиковки налетов мозаик главного и малых иконостасов.
Состояние написанных маслом на холсте произведений в нишах опорных кирпичных пилонов, в большей степени пропитанных влагой, ухудшалось с каждым днем. На живописных полотнах наблюдалось полное разложение лака и большие очаги плесени. Двадцать картин на тяжелых подрамниках высотой почти четыре метра были аккуратно сняты силами научных сотрудников, просушены, очищены от плесени и в 1944 году отправлены на реставрацию в мастерские Государственного Эрмитажа.

25 июля 1945 года Исполком Ленгорсовета принял решение о реэвакуации коллекций музея из Сарапула, которая по ряду причин затянулась на несколько месяцев. Музейные ценности ГАМа – и те, которые вернулись из Сарапула, и частично те, которые оставались в годы войны в соборе (в основном церковные облачения) – на время первичных ремонтно-реставрационных работ были перенаправлены в Центральное хранилище музейных фондов пригородных дворцов-музеев УКППЛ, располагавшееся в г. Пушкине. В собор вещи возвращались партиями.

Директором музея в октябре 1945 года был назначен Даниил Абрамович Соловей. При нем начались послевоенные восстановительные работы: ремонт кровли, инженерных сетей, водопровода и канализации. Вся внутренняя отделка – бронза, мозаика, мраморная облицовка – были подвергнуты очистке от грязи и промыты водой.

В первую очередь в здании собора произвели ремонт инженерных сетей, канализации, водопровода и частично электроосвещения. Был разобран кирпич в окнах основного объема, выполнявший защитные функции с самого начала войны, и остеклены оконные переплеты на всех ярусах здания; частично реконструированы печи и калориферы, отремонтирована кровля и промыта от защитной краски позолота куполов. Следует отметить, что сделанная «через огонь» позолота оказалась достаточно прочной, и главный купол не нуждается в повторном золочении до настоящего времени. В течение нескольких месяцев для посетителей была подготовлена смотровая площадка собора. С 23 сентября 1945 года по 1 января 1946 года колоннаду смогли посетить одиннадцать тысяч человек.

Сложность управления музеем в первые послевоенные годы заключалась в том, что наряду с большим объемом реставрационных работ требовалось готовить музей к открытию. В связи с этим на должность директора Государственного антирелигиозного музея был возвращен имевший большой положительный опыт научно-административной работы И. М. Штрейхер. При нем заканчиваются первоочередные послевоенные восстановительные работы и начинаются масштабные реставрационные работы в интерьере собора.

Во время войны собору был нанесен колоссальный ущерб. Повреждения были вызваны разрывами снарядов и взрывными волнами. Но самым страшным врагом памятника стали холод и отсутствие отопления. От сырости и протечек разрушалось декоративное убранство – покрытая позолотой лепнина, монументальная живопись, мозаики, мраморная облицовка. Восстановить все и сразу, а также открыть музейную экспозицию в короткие сроки оказалось невозможным. Требовался ряд специальных мероприятий, учитывающих состояние и особенности самого здания.

Художники Ленинградских архитектурно-реставрационных мастерских Р. П. Саусен, С. Ф. Коненков и другие под руководством опытного специалиста Н. В. Перцева приступили к первоочередным работам по укреплению настенных росписей собора во избежание их разрушения. В течение трех лет они занимались консервацией наиболее пострадавшей монументальной и станковой живописи, что позволило максимально сохранить авторскую технику и предотвратить дальнейшее разрушение. Работы были выполнены на площади порядка 450 кв. м. По специально составленной методике красочный слой был укреплен осетрово-медовым клеем. Для укрепления грунта был использован связующий состав из воска, смол и скипидара.

По завершении первоочередных послевоенных восстановительных работ музей открывается для посетителей. Он получает новое название – Государственный музей-памятник «Исаакиевский собор» (ГМП «Исаакиевский собор»).
Открытие музея состоялось 12 декабря 1948 года и стало заметным событием в культурной послевоенной жизни города. Надо отметить, что работал музей в сложных условиях, в соборе велись реставрационные работы, продолжавшиеся до 1963 года.
В это трудное время велась прерванная войной работа по созданию вспомогательной экспозиции с «показом самого здания, его конструкций и элементов художественного убранства». Она была подготовлена за два года и включала пять разделов.
Первый и второй разделы представляли Исаакиевский собор как крупнейший памятник русской архитектуры середины XIX века и как памятник труда и таланта русского народа.
Третий раздел был посвящен архитекторам, художникам, скульпторам, мозаичистам, участвовавшим в создании художественного убранства здания.
В четвертый раздел «От собора к музею» вошли материалы, освещающие деятельность музея как культурно-просветительного центра.
Пятым, дополнительным разделом стала демонстрация опыта с маятником Фуко. Новой экспозиции соответствовала и новая обзорная экскурсия. В методической разработке к ней был предусмотрен обязательный художественный анализ живописных произведений. В частности, разбор росписей Карла Брюллова и Федора Бруни, помимо иконографии и техники исполнения, включал довольно сложный стилистический анализ.

4 января 1949 года Исполком Ленинградского горсовета утверждает «Положение о Государственном музее-памятнике «Исаакиевский собор», согласно которому он становится научно-исследовательским и культурно просветительным учреждением. Его основной целью является «изучение и показ самого Исаакиевского собора как исторического и художественного памятника, в целях совершенствования атеистической пропаганды среди трудящихся». Согласно новому статусу создаются и перестраиваются его хранилища, библиотека, фототека, научный, экспозиционный, методический отделы и кабинеты при них. Музею вменяется в обязанность пополнение фондов не только «материалами атеистического содержания», но и экспонатами «исторического и художественного назначения», а также организация их строгого учета, контроля и хранения.